組織分離是一種用子實體的某一部分來分離菌種的方法。 

因為組織分離法操作簡便，不易帶入雜菌，容易獲得純菌種。后代不易發生遺傳重組等變異，能保持原菌株的優良特性。因此組織分離是目前應用最廣泛的分離手段。

1. 選擇無污染并菇形健壯的蘑菇幼菇(6分成熟)，采摘后及時放入滅過菌的紙袋中帶回接種室，連同母種用試管培養基等用品一起放入接種箱或超凈工作臺內消毒。

2. 先用75%的酒精消毒雙手，將鑷子、接種鏟、小刀等接種用用具用酒精消毒，用酒精棉擦一下，拿到酒精燈上燒一下。

3. 用略干的酒精棉球將子囊果菌柄特別是基部與土壤交界處的灰塵或泥土擦拭干凈，擦拭過程中及時更換酒精棉球。

4. 切開羊肚菌，切取菌柄與菌蓋交接處組織較厚的部位，什么地方肉厚用什么地方，切取菌柄2~5mm組織塊2~3塊，用鑷子夾住，將組織塊在無菌水中涮一下，并在酒精燈上快速過幾下。（過程中少用升汞或酒精消毒，避免將羊肚菌菌絲全部殺死。）

5. 將組織塊放入培養皿培養，在22~25℃避光培養，2~3d萌發出新菌絲，新菌絲長到培養基上，48小時后，此時菌絲長約0.2~ 0.4 cm，菌絲粗壯；56 ~ 72小時后，成功萌發的菌絲將長至0.5 ~ 1.5 cm長，菌絲纖細，無色，不濃密，前端近似整體，根根分明，此時可挑取菌落尖端進行挑出純化。

6. 純化后的試管要貼上標簽，注明接種日期和品種的名稱。

7. 純化的羊肚菌12 h左右，可見到從接種塊萌發到培養基上的新生菌絲，7天左右長滿試管，并出現白色菌核，10天左右，小菌核由初始的白色，逐漸變淺黃、變大；培養15天左右后可放4度冰箱保存。

得到純菌種后進行轉管操作，15～18天菌絲即可長滿試管，挑選菌絲健旺、無污染的菌管再進行轉接擴繁，須經出菇試驗合格后用于生產。

羊肚菌皮薄，遇水，酒精不會萌發。根據以上方法，可進行多次試驗。（從業者需根據實驗操作來調整相關細節，以上操作僅供參考。）

注：羊肚菌作為一種子囊菌，與其他食用菌相比最大缺點是容易退化，變異和生霉。因此，分離菌種要進行出菇和比較試驗。